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熒光顯微技術(shù)在黎族藥物大青鑒定中的應(yīng)用
閱讀：426 發(fā)布時間：2013-4-8黎族藥物大青來源于馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., 其根、莖、葉入藥，夏秋季采收，洗凈，鮮用。長期以來在華南地區(qū)常代替*使用［1-3］。其黎藥名為雅楓能，莖葉入藥，具有清熱解毒的功效［4］。前人已對其根、莖的橫切片顯微結(jié)構(gòu)進行了研究，但是對莖粉末結(jié)構(gòu)的研究未見報道，在葉結(jié)構(gòu)方面,也未見有研究報道［5］。另外，以往研究均利用普通光學(xué)顯微鏡，均需用試劑處理，才能觀察，并需一定的繪圖機能。在熒光技術(shù)方面，以往的熒光分析技術(shù)需將有效成分用試劑提取后才能在熒光分光光度計下測量其熒光光譜［6,7］，操作較麻煩。在葉片研究方面有報道認為利用熒光顯微鏡可觀察氣孔形狀，但不知對葉片其他結(jié)構(gòu)形態(tài)是否有效［8］，因此，在本研究中通過嘗試對未經(jīng)試劑處理的生藥粉末和新鮮葉片在熒光顯微鏡下，進行觀察，以探討利用熒光顯微技術(shù)進行生藥顯微鑒定的可行性,為開拓一種簡便有效的顯微鑒定方法，同時為黎族藥物大青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及開發(fā)黎藥提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., 從海南醫(yī)學(xué)院黎族藥用植物觀賞園采集，將其莖去掉葉片后曬干粉碎，取其粉末作為試驗材料。另外在實驗前夕取成熟大青葉片一塊，沖洗干凈晾干備用。所用儀器為研究級正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）。
1.2 方法
在研究級正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）的
光下找到大青莖粉末觀察目標(biāo)，再關(guān)上光柵，在熒光下觀察，并拍照。從備用大青葉片中間剪取2mm×2mm的葉塊，背面朝上置于載玻片蓋上蓋玻片后,同樣先在自然光下找到觀察目標(biāo)，再關(guān)上光柵，在熒光下觀察，并拍照。
2 結(jié)果
粉末淡黃色，含有的纖維主要有3種，即X形，L形和分叉狀等纖維（圖1A～C），木栓細胞表面觀四邊形，排列較整齊（圖1D），晶鞘纖維含量豐富，里面同樣含有很多數(shù)量的方晶（圖1E）。導(dǎo)管多破碎，多為網(wǎng)紋導(dǎo)管（圖1F～G），在粉末中含有鐘乳體、石細胞（圖1H～I）,在木部薄壁細胞可看到一圈綠色的熒光，很快消失。在粉末中含有一定數(shù)量的非腺毛和腺毛（圖1J～K），值得注意的是在表皮細胞中還有許多銅錢狀的分泌組織（圖1L）。
大青葉下表皮淺綠色，在熒光顯微鏡下其角質(zhì)層細胞垂周壁波狀或深波狀彎曲（圖1M），在葉表皮中可以看到存在鐘乳體（圖1N），單位面積上氣孔數(shù)量較多，同時也存在較多2細胞的腺毛，及少量非腺毛（圖1O）。
3 討論
3.1 大青莖粉末結(jié)構(gòu)與大青莖橫切片結(jié)構(gòu)比較
據(jù)
報道［3］, 大青莖（徑約5mm）之橫切面，zui外緣表皮細胞，散見非腺毛；皮層韌皮纖維與石細胞，多個連生，排列成環(huán)，強木化，形成層，2～3層，細胞小，呈類長方形或扁長方形。木質(zhì)部，由導(dǎo)管、木部薄壁細胞、髓線所組成，導(dǎo)管單個或2～4個連生，主要為網(wǎng)紋導(dǎo)管；髓線細胞呈類長方形、類方形及扁長方形；木部薄壁細胞，與導(dǎo)管伴生，細胞呈類長方形、類方形及扁長方形。*為髓部，散見石細胞及草酸鈣方晶。
本組研究中，大青粉末除含有上述非腺毛、石細胞、方晶、導(dǎo)管、纖維外還具有少數(shù)腺毛和鐘乳體，而鐘乳體是馬鞭草科植物的一個顯著特征。另外纖維的種類也較豐富，因此粉末研究是生藥顯微研究中*的內(nèi)容。由于大青在華南地區(qū)分布比較廣泛，但不同地區(qū)其有效成分的含量有所不同，其有效成分的含量高低直接影響其
效果，而在熒光顯微鏡下可在木部薄壁細胞觀察到一圈顯著的綠色熒光，這可能是大青莖有效成分的存在部位，根據(jù)其熒光強度的不同可比較來源于不同地區(qū)的大青莖質(zhì)量的優(yōu)劣。
以往對生藥粉末形態(tài)觀察一般先采用*透化，*裝片后再在普通光學(xué)顯微鏡觀察，由于受*等試劑的影響，觀察效果不是較理想，且觀察的結(jié)構(gòu)形態(tài)一般平面狀態(tài)；但是在熒光顯微鏡下操作步驟簡便，生藥不須試劑處理，可直接用粉末裝片觀察，由于無甘油等試劑干擾影響，其視野潔靜，結(jié)構(gòu)層次感較強。如所觀察的晶纖維、木栓細胞等，因此，整體效果要優(yōu)于普通光學(xué)顯微鏡。更重要的是，在熒光顯微鏡下，有些結(jié)構(gòu)可發(fā)出熒光，如大青莖粉末含有的不同纖維發(fā)出的熒光及亮度不一樣，為我們鑒別不同種類的生藥提供了重要的依據(jù)。
3.3 不同顯微鏡觀察大青新鮮葉結(jié)構(gòu)效果的比較
在熒光顯微鏡下觀察新鮮大青葉片的下表皮，能夠清晰地觀察到氣孔的數(shù)量及腺毛、非腺毛，其次在葉片上觀察到其存在著一定數(shù)量的鐘乳體，立體狀的波紋狀角質(zhì)層細胞也很容易觀察，另外可清晰地看到氣孔的開合狀態(tài)，在一定程度上利用熒光顯微鏡可代替掃描
顯微鏡觀察上述葉片結(jié)構(gòu)。關(guān)于氣孔類型，已有的關(guān)于馬鞭草科氣孔的觀察研究通過解離染色方法證明該科中氣孔類型較為豐富，有直軸式、平周式、不定式等［5］，但在熒光顯微鏡下葉片氣孔的類型不好判別，因此其有一定缺陷，而據(jù)我們在光學(xué)顯微鏡下將大青葉下表皮撕裂后加蒸餾水后觀察，大青葉氣孔類型很容易就能被判斷為無規(guī)則形，因此判別葉片氣孔的類型還需利用將下表皮撕裂或解離后等方法再在普通光學(xué)顯微鏡觀察才方便。
近年來，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，迅速地推動了中藥或生藥鑒定的
［9,10］，關(guān)于生藥顯微鑒別儀器，常見的有普通光學(xué)顯微鏡、偏振光顯微鏡、掃描電子顯微鏡等，利用熒光顯微鏡進行化學(xué)成分組織定位也有報道［11］，但zui常見的儀器是光學(xué)顯微鏡，在鑒別生藥方面熒光顯微鏡的使用還未見報道。我們利用熒光顯微鏡觀察黎族藥物大青莖粉末和新鮮葉片顯微構(gòu)造是一次成功的嘗試，它為生藥顯微鑒定開拓了一條新的途徑，且操作簡便，無須任何試劑處理，保留了生藥的原樣，圖像更加直觀、清晰，值得深入研究。但也需要注意，有些部位熒光消失較快，需快速觀察。本組資料只探討了定性實驗問題，其他涉及到如何對化學(xué)成分進行定量等問題還需繼續(xù)探討，但是至少我們知道化學(xué)成分存在的部位，這為我們繼續(xù)改進實驗提供了契機。由于本次研究材料中無淀粉粒結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)在熒光顯微鏡下效果如何？有待下次在其他材料中研究。